支原體基因組DNA提取試劑盒（離心柱法）說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實驗試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè)，圓夢中國。

產(chǎn)品詳情

產(chǎn)品描述

《支原體基因組 DNA 提取試劑盒》（離心柱法）（Mycoplasma Genomic DNA Extraction Kit with Columns）的操作方法和試劑配方已經(jīng)針對支原體的特點做了優(yōu)化，專門用于從體外培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞上 清、血清、血漿、全血、生物制品等樣品中提取支原體基因組 DNA。提取的支原體基因組 DNA 可用于《一 步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR 法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》。

支原體基因組 DNA 的提取有兩個作用：

（1）可以去除所有可能抑制 PCR 擴(kuò)增的成分或者干擾《一步法 恒溫支原體檢測試劑盒》顯色的成分，保證后續(xù) PCR 擴(kuò)增的正常進(jìn)行或者《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》 的顯色不被干擾；

（2）具有濃縮支原體 DNA 的作用，可以提高相對檢測靈敏度 10-100 倍。

產(chǎn)品組分

蛋白酶 K 溶液：Proteinase K（20 mg/mL） 1 mL

溶液 GR：Buffer GR 15 mL

溶液 GL：Buffer GL 15 mL

清洗液 GW1：Buffer GW1(Concentrate) 13 mL

清洗液 GW2：Buffer GW2(Concentrate) 15 mL

洗脫液 EB：Elution Buffer EB 15 mL

吸附柱：Spin Columns DM 50 個

收集管：Collection Tube 50 個 

使用方法

使用方法

1.實驗前準(zhǔn)備及重要注意事項

1) Buffer GW1 和 Buffer GW2 的配制：第一次使用前，應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在 Buffer GW1 和 Buffer GW2 中加入無水乙醇，并在試劑瓶標(biāo)簽中做好標(biāo)記。

2) 使用前請檢查 Buffer GL 是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀，請將 Buffer GL 于 56?C 水 浴孵育重新溶解。

2. 樣品處理：本試劑盒優(yōu)選體外培養(yǎng)的細(xì)胞上清（貼壁細(xì)胞直接取細(xì)胞培養(yǎng)上清、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞取低速 離心后的離心上清）、血清、血漿、溶液型生物制品作為提取支原體基因組 DNA 的樣品。如果是粉末 型樣品，需用水溶解后，再進(jìn)行后續(xù)操作。

注 1：體外培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)上清或懸浮細(xì)胞，經(jīng) 1200 rpm（約 150 g）低速離心 5 分鐘后（切 記：此步驟離心力不能太大，否則支原體會被離心去除了！），取離心后上清進(jìn)行檢測。

注 2：如果初始樣品是加了抗凝劑的全血，經(jīng) 1200 rpm（約 150 g）低速離心 10 分鐘后（切記： 此步驟離心力不能太大，否則支原體會被離心去除了！），取上層血漿進(jìn)行檢測。

注 3：如果初始樣品是未加抗凝劑的全血，待血液凝固后，取血清進(jìn)行檢測。

3. 取上述細(xì)胞上清、血清、血漿、生物制品等樣品 200 μL，用移液槍吹吸均勻后，進(jìn)行后續(xù)操作。

注 1：當(dāng)樣品量小于 200 μL 時，加入 Buffer GR 補足至 200 μl，再進(jìn)行下一步實驗。

注 2：如果預(yù)期待測樣品支原體含量較少（比如長期低溫保存的血清、血漿、胰酶、生物制品等）， 可以取上述樣品 1 mL，加入 1.5 mL 離心管內(nèi)，13000 rpm（約 16000 g）高速離心 5 分鐘。吸走 離心后的上清 800 μL，剩余 200 μL 用移液槍吹吸均勻后，進(jìn)行后續(xù)操作。此步驟起濃縮支原體的 作用，從而提高支原體檢測的相對靈敏度。如果需要，上述樣品的體積可以進(jìn)一步放大，經(jīng)過多 次高速離心后，剩余 200 μL 用于后續(xù)操作（比如，如果初始體積是 5 mL，經(jīng) 5 次高速離心，取剩 余的 200 μL 進(jìn)行后續(xù)操作，最終用 50 μL 洗脫液進(jìn)行洗脫，則支原體 DNA 大約濃縮了 100 倍，支 原體檢測的相對靈敏度也大約提高了 100 倍。）

4. 向以上溶液中加入 20 μL Proteinase K（20 mg/mL）溶液，混勻。

5. 加入 200 μL Buffer GL（如果室溫較低，使用前請檢查 Buffer GL 是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶 或者沉淀，請將 Buffer GL 于 56?C 水浴孵育重新溶解），用吸頭充分吹吸均勻或用 Vortex 充分震蕩。

注意：不要將 Proteinase K 和 Buffer GL 進(jìn)行預(yù)混，否則 Proteinase K 可能失活。

6. 將離心管放置 56?C 水浴，孵育 15 分鐘。

注意：此步驟不能省略！

7. 加入 2 μL 支原體 qPCR 內(nèi)參質(zhì)粒 mycoIC2（注意：內(nèi)參質(zhì)粒 mycoIC2 請吹吸均勻后，再加入。內(nèi)參質(zhì)粒 mycoIC2 只在本公司《探針法支原體檢測試劑盒》內(nèi)含有，如果使用其他支原體檢測方法，本步驟可以 跳過！）。

注 1：此步驟只有使用本公司《探針法支原體檢測試劑盒》時，需要加入支原體 qPCR 內(nèi)參質(zhì)粒 mycoIC2。

注 2：加入的內(nèi)參質(zhì)粒 mycoIC2 用于監(jiān)控支原體 DNA 的提取和后續(xù)支原體 qPCR 的擴(kuò)增是否有效。

8. 加入 200 μL 無水乙醇，上下顛倒混勻數(shù)次。 l 注意：此處不能高速離心！如果需要（一般不需要離心），只能 1000 rpm（約 100 g）低速短暫 離心（20 Sec），使管壁和壁蓋上的液體集中到管底。

9. 用 1 mL 吸頭將所得溶液全部（含管壁和蓋子上溶液）加入到已裝入收集管的吸附柱(Spin Columns DM） 中。12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10.向吸附柱中加入 500 μL Buffer GW1（使用前檢查是否加入無水乙醇!）,蓋上蓋子，將吸附柱快速顛倒 一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質(zhì)），12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 重新放回收集管中。

11.向吸附柱中加入 500 μL Buffer GW2（使用前檢查是否加入無水乙醇!），蓋上蓋子，將吸附柱快速顛 倒一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質(zhì)），12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附 柱重新放回收集管中。

12.再次清洗：向吸附柱中加入 600 μL Buffer GW2（使用前檢查是否加入無水乙醇!），蓋上蓋子，將吸附柱快速顛倒一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質(zhì)），12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。

13.繼續(xù) 12,000 rpm 離心 2 分鐘。離心后，在亮光下，仔細(xì)檢查吸附柱內(nèi)部吸附膜上方的塑料墊圈四周是 否有液體殘留。如果發(fā)現(xiàn)吸附柱內(nèi)部塑料墊圈四周有液體殘留，可以將吸附柱放回收集管內(nèi)，將有液 體殘留的一側(cè)放在離心力內(nèi)側(cè)，繼續(xù) 12,000 rpm 離心 1 分鐘。

14.離心后，經(jīng)仔細(xì)檢查，如果確認(rèn)吸附柱內(nèi)部塑料墊圈四周沒有液體殘留，則可以丟棄收集管，將吸附柱 置于一個新的 1.5 mL 離心管（自備）中，打開吸附柱蓋子，置于 50-65℃的烘箱內(nèi)放置至少 15 分鐘， 以讓吸附膜中的乙醇揮發(fā)干凈（請務(wù)必放在 50-65℃的烘箱內(nèi)放置！如果室溫放置，不僅時間需要 延長，還不排除有些樣品由于乙醇揮發(fā)不干凈，影響后續(xù) PCR 擴(kuò)增效率，甚至失敗）。

注意：打開吸附柱蓋子，將吸附柱放在 50-65℃的烘箱內(nèi)至少 15 分鐘，此步驟非常關(guān)鍵！如果沒 有烘箱，強(qiáng)烈建議購買一個。這一步的目的是將吸附膜中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會嚴(yán) 重影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（如：酶切、PCR 擴(kuò)增等），甚至可能導(dǎo)致后續(xù)的 PCR 失敗。

15.向吸附柱的中間部位懸空加入 50 μL Elution Buffer EB，室溫放置 3 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘， 收集 DNA 溶液，-20℃保存。

運輸及保存方法

該產(chǎn)品常溫運輸，室溫保存（收貨后，其中的 Proteinase K 放-20?C 保存）。該條件下，至少 3 年內(nèi)有 效。Proteinase K 溶液可以在室溫保存 2-3 個月，長期保存需要放-20?C。