BioGrammatics PS005-01說明書

BioGrammatics—糖基化畢赤酵母表達體系

Pichia酵母菌屬的巴斯德畢赤酵母是當今常用的單細胞真核表達體系，是載體構建、表達、發酵和純化重組蛋白和肽的優良體系。BioGrammatics在畢赤酵母的生命科學研究利用領域有著悠久的歷史和豐富的經驗，通過與Research Corporation Technologies（RCT）合作開發出GlycoSwitch®技術，利用該技術可以在畢赤酵母中表達的蛋白加以改性糖基化修飾。糖基化可影響蛋白質折疊，穩定性和蛋白質 - 蛋白質相互作用，因此利用GlycoSwitch®技術可設計具有更多“人類”糖基化特征的蛋白質，用以研發適用于人類的的生物藥物，以及改良常規重組蛋白質。目前BioGrammatics可提供的基于畢赤酵母的產品包括快速簡單的蛋白質表達、分子表達工具下的菌株設計（如強大的嚴格調控的啟動子，的分泌基因組操作）、大規模高細胞密度酵母發酵（> 700 g / l wcw，200k升）、特定的酵母發酵條件設計、真核蛋白質加工（折疊，分泌，糖基化）及酵母遺傳學分析等服務。

SuperMan5 (his—)

Description:

GlycoSwitch® strain, Man5 N-linked oligosaccharide structures (histidine auxotroph)

描述：

GlycoSwitch ®應變，曼5 N-連接的寡糖的結構（組氨酸營養缺陷型）

SuperMan5（his-），Och1-破壞與pGAP-甘露糖苷酶表達盒，殺稻瘟素抗性）。GS115（his4-），來自里氏木霉的α1,2-甘露糖苷酶，由具有殺稻瘟素抗性基因的質粒上的GAP啟動子調節，破壞SuperMan5基因組中的Och1基因。

BioGrammatics公司產品：

一、畢赤酵母表達載體

重組蛋白在畢赤酵母中的表達常見于表達載體整合到畢赤酵母基因組中，基因組整合導致目的基因在畢赤酵母中穩定表達。通過大規模的表達菌株發酵可生產大量的目的蛋白質。基于目的蛋白和基因的自身特異性，在載體設計時需要考慮以下因素：1）胞內表達或者分泌表達；2）適宜的啟動子（誘導型，組成型，強，弱）；3）選擇標記；4）特定基因/ （開放閱讀框）ORF序列；5）表達盒在畢赤酵母基因組中適的位置。

BioGrammatics在畢赤酵母表達載體研究領域擁有豐富的經驗，創建并測試了大量的表達載體，以優化數百種基因的表達和用于特定的應用，包括細胞內和細胞外表達，膜蛋白的表達，高水平蛋白質生產以及蛋白質在代謝途徑中的表達和支持重組蛋白質產物宜加工程度的蛋白質。

BioGrammatics采用的pJ載體（pJ – vectors, Jeannies vectors)是4-5kb的質粒，帶有氨芐青霉素篩選基因和“無縫”克隆方案。克隆方案基于在其識別序列之外切割的IIS型限制酶，因此，可在終表達載體中去除限制酶結合位點，并且可以在不多加入不需要的密碼子的情況下加入ORF。

二、畢赤酵母表達菌株

BioGrammatics提供BG和GlycoSwitch®菌株兩種畢赤酵母表達菌株系列。其中BG菌株來源于野生巴斯德畢赤酵母菌株，初于1940年由加利福尼亞的Herman Phaff分離。我們使用Illumina HiSeq技術對Phaff菌株進行單菌落分離，成為BioGrammatics起始的原始菌株BG08，BG08在經過改良以消除細胞質殺傷質粒的能力產生野生型表達菌株BG10。此后除了BG09之外，BG系列中的所有后續菌株均通過的BG10基因組操作衍生而來。 而BG09是BG08的一個特定變體，已開發用于在特定的胰蛋白酶切割位點標記13C同位素后進行質譜分析。

除BG系列外，BioGrammatics還是RCT的GlycoSwitch®菌株經銷商。 GlycoSwitch®菌株系列源于20世紀70年代的巴斯德畢赤酵母GS115菌株，是Phaff菌株的突變分離株之一，選擇用于組氨酸營養缺陷型培養。初的GlycoSwitch®Man5菌株來源于比利時根特大學和法蘭德斯生物技術研究所（VIB）的Roland Contreras博士，Nico Callewaert博士及其同事的合作分離。 SuperMan5菌株是由BioGrammatics研發的GlycoSwitch®Man5的后續修飾菌株，其突變體och1基因座的所有同源性區域基因已被去除以防止其通過同源重組而逆轉為野生型。

三、具有修飾糖基化的畢赤酵母菌株 - GlycoSwitch®技術。

GlycoSwitch系列菌株是與BioGrammatics與Research Corporation Technologies（RCT）合作，提供個可進行糖基化修飾的畢赤酵母表達載體。糖基化可影響蛋白質折疊，穩定性和蛋白質 - 蛋白質相互作用，因可用于設計生成具有更多“人類”糖基化的蛋白質和生物制藥，以及改良其他類別的重組蛋白質。其核心GlycoSwitch®菌株具有中心聚糖加工酶（OCH1），可阻止聚糖延伸，并表達外源甘露糖苷酶以將現有聚糖修剪成更均勻的Man5結構。此外，BioGrammatics還可提供基于GlycoSwitch®技術的定制化研發合同服務，使用BioGrammatics公司的豐富的Pichia專業技術為客戶提供特定應用的量身定制糖蛋白。

四、畢赤酵母表達系統培養基

該系列產品于畢赤酵母表發體系發酵培養或擴增，包括干粉和濃縮液，用于配制100ml和2.5L的培養液。

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