骨組織消化手冊

更新時間：2016-02-17

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Worthington組織消化指南

引言

組織消化酶主要用于組織培養和細胞生物學研究的原代細胞的分離和收集。盡管這些消化酶已經普遍應用多年，但是對其組織消化和細胞收集的作用機制卻沒有全面的理解。由此導致的結果便是選擇一種消化方法大多是隨機選擇或基于過去的經驗，而不是在*理解消化原理的基礎上選擇的消化方案，以及如何根據具體實驗目的修正消化方案以獲得更好的實驗結果。

細胞分離程序的目的是zui大程度的獲得功能活性的單個細胞，而影響結果的原因有很多，包括（不限于）以下：

1、組織類型

2、物種來源

3、動物年齡

4、遺傳改造情況（如knockouts）

5、所用的消化培養液

6、所用的酶

7、消化酶中的雜質

8、所用消化酶的工作濃度

9、溫度

10、孵育時間

通常前四個原因沒辦法選擇，而剩下的原因一般由經驗決定以獲取zui適實驗結果。

通過查閱文獻來選擇*組織消化酶和zui適消化條件的研究人員通常被互相矛盾的實驗數據搞得一頭霧水。這些巨大差異來源于組織胞外基質的復雜而動態的特性，以及過去常用的粗制、未提純的組織分離酶。另外，組織胞外基質由各種蛋白、糖蛋白、脂類和糖脂組成，這些成分的組成比例在不同物種、不同組織、甚至不同發育（年齡）之間存在明顯的差異，這些因素都極大的影響了消化方案的制定。目前通常使用的粗制酶，如鏈霉蛋白酶、NF1:250、以及含有幾種其他不同濃度蛋白酶的膠原酶、以及各種多糖酶、核酶和脂酶。

本指南總結了目前常用組織消化酶的zui適消化和細胞收集知識和方法，描述了標準的實驗步驟，以便于制定一個*的細胞分離方案，同時列舉了一些相關的參考文獻。

下表列出多種組織的適宜消化酶（含參考文獻，以組織類型和物種分類，詳見鏈接）

脂肪組織	腎上腺組織	骨組織	腦組織
軟骨組織	結腸組織	內皮組織	上皮組織
眼	心臟	腸	腎
肝	肺	淋巴結	乳腺
其它組織	其他組織	肌組織	神經組織
胰腺	腮腺	垂體	前列腺
生殖	動物鱗片	皮膚	脾臟
干細胞	胸腺	甲狀腺/甲狀旁腺	扁桃體
腫瘤

注：使用Worthington公司消化酶的文獻不限于上表鏈接中所列，一般而言，Worthington公司的組織消化酶可用于大多組織類型的消化。

骨組織消化手冊

物種	詳細來源	細胞名稱	消化用酶	培養基	參考文獻
牛	牛	Chondrocytes	Collagenase Type 2: 0.4%	DMEM	Buschmann, M., Gluzband, Y., Grodzinsky, A., and Hunziker, E.: Mechanical Compression Modulates Matrix Biosynthesis in Chondrocyte/Agarose Culture, J Cell Sci 108, 1497, 1995
雞	日齡小雞	Osteoblasts	Trypsin: 0.03%	DMEM	Gay, C., Lloyd, Q., and Gilman, V.: Characteristics and Culture of Osteoblasts Derived From Avian Long Bone, In Vitro Cell Dev Biol 30A, 379, 1994
雞	小雞, 彼得森/喬木英畝, 雄性, 4 周老(家雞)	Chondrocytes	Trypsin: 0.25%	Ham's F12	Rosselot, G., Reginato, A.M., and Leach, R.M.: Development of a Serum-Free System to Study the Effect of Growth Hormone and Insulinlike Growth Factor-1 on Cultured Postembryonic Growth Plate Chondrocytes, In Vitro Cell Dev Biol 28A, 235, 1992
雞	小雞, 胚胎	Vertebrae chondroblasts	Trypsin: 0.25%	Simm's, CMF	Schiltz, J.R., Mayne R., and Holtzer, H.: The Synthesis of Collagen and Glycosaminoglycans by Dedifferentiated Chondroblasts in Culture, Differentiation 1, 97, 1973
人類	人類, 22-73 歲	Osteoblasts	Trypsin: 0.5%	Basal Medium	Kneser U, Voogd A, Ohnolz J, Buettner O, Stangenberg L, Zhang YH, Stark GB, Schaefer DJ:Fibrin gel-immobilized primary osteoblasts in calcium phosphate bone cement: in vivo evaluation with regard to application as injectable biological bone substitute, Cells Tissues Organs 179, 158-69, 2005
人類	人類, 60歲以上	Bone Cells, Osteoblasts	Collagenase Type 2: 200-250 u/ml	DMEM	Chen X., Qian H., Neff L., Satomura K., and Horowitz M.: Thy-1 antigen Expression by Cells in the Osteoblast Lineage, J Bone Miner Res 14, 362, 1999
人類	人類	Osteoblasts	Trypsin: 0.1%	DMEM	Meikle, M., Boyd, S., Hembry, R., Compston, J., Croucher, P., and Reynolds, J.: 人類 Osteoblasts in Culture Synthesize Collagenase and Other Matrix Metalloproteinases in Response to Osteotropic Hormones and Cytokines, J Cell Sci 103, 1093, 1992
人類	人類	Osteoblasts	Collagenase Type 4: 250 u/ml	DMEM	Fedarko, N.S., Termine, J.D., Young, M.F. and Robey, P.G.: Temporal Regulation of Hyaluronan and Proteoglycan Metabolism by 人類 Bone Cells in Vitro, J Biol Chem 265, 12200, 1990
小鼠	小鼠	Bone Stromal cells	Collagenase Type 1: 0.3%	DMEM	Igarashi, H., Akahoshi, N., Ohto-Nakanishi, T., Yasuda, D. and Ishii, S.: The Lysophosphatidic Acid Receptor LPA4 Regulates Hematopoiesis-Supporting Activity of Bone Marrow Stromal Cells.,Sci Rep 5, 11410, 2015
小鼠	小鼠	Osteoblasts	Collagenase Type 1: 1.0%	MEM	Lee, D., Choung, H., Kim, H., Gronostajski, R., Yang, Y., Ryoo, H., Lee, Z., Kim, H., Cho, E. and Park, J.: NFI-C Regulates Osteoblast Differentiation Via Control of Osterix Expression., Stem Cells 32, 2467-79, 2014
小鼠	小鼠	Osteoblasts	Neutral Protease: 1.6%	MEM
小鼠	小鼠, 4-22 月	Osteocytes	Collagenase Type 1: 300 u/ml	MEM	Stern, A., Stern, M., Van Dyke, M., Jahn, K., Prideaux, M. and Bonewald, L.: Isolation and Culture of Primary Osteocytes from the Long Bones of Skeletally Mature and Aged Mice.,Biotechniques 52, 361, 2012
小鼠	小鼠	Endosteal cells	Collagenase Type 1: 0.3%	DMEM	Nakamura, Y., Arai, F., Iwasaki, H., Hosokawa, K., Kobayashi, I., Gomei, Y., Matsumoto, Y., Yoshihara, H. and Suda, T.: Isolation and Characterization of Endosteal Niche Cell Populations that Regulate Hematopoietic Stem Cells., Blood 116, 1422, 2010
小鼠	小鼠	Bone marrow	Collagenase: 0.2%	DMEM	Morikawa, S., Mabuchi, Y., Kubota, Y., Nagai, Y., Niibe, K., Hi大鼠su, E., Suzuki, S., Miyauchi-Hara, C., Nagoshi, N., Sunabori, T., Shimmura, S., Miyawaki, A., Nakagawa, T., Suda, T., Okano, H. and Matsuzaki, Y.: Prospective Identification, Isolation, and Systemic Transplantation of Multipotent Mesenchymal Stem Cells in Murine Bone Marrow., J Exp Med 206, 2483-96, 2009
小鼠	小鼠, male, 6-8 week old	Osteoclasts	Collagenase Type 3: 0.1%	DMEM	Sakai, E., Miyamoto, H., Okamoto, K., Kato, Y., Yamamoto, K., and Sakai, H.: Characterization of Phagosomal Subpopulations Along Endocytic Routes in Osteoclasts and Macrophages, J. Biochem. 130, 823, 2001
小鼠	小鼠, 3-5 天, 6-8 周	Bone Cells, Osteoblasts	Collagenase Type 2: 200-250 u/ml	DMEM	Chen X., Qian H., Neff L., Satomura K., and Horowitz M.: Thy-1 antigen Expression by Cells in the Osteoblast Lineage, J Bone Miner Res 14, 362, 1999
小鼠	小鼠, 白變種實驗室老鼠	Osteoblast-like Cells	Trypsin: 0.1%	Eagle's MEM	Takanashi, H., Matsuishi, T., and Yoshizato, K.: Establishment and Characterization of Stromal Cell Lines That Support Differentiation of Murine Hematopoietic Blast Cells into Osteoblast-like Cells, In Vitro Cell Dev Biol 30A, 384, 1994
		Stromal Cell Lines
		Hematopoietic Blast Cells
小鼠	小鼠, 遠交群小鼠	Neonatal bone	Collagenase Type 2: 0.20%	Tris-buffered saline	Chen,T. and Feldman,D.: Regulation of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Receptors in Cultured 小鼠 Bone Cells, J Biol Chem 256, 5561, 1981
大鼠	大鼠,胎兒, 21 妊娠日	Calvaria	Collagenase: 0.2%	MEM	Owen, T., Aronow, M., Shalhoub, V., Barone, L., Wilming, L., Tassinari, M., Kennedy, M., Pockwinse, S., Lian, J., and Stein, G.: Progressive Development of the 大鼠 Oseoblast Phenotype In Vitro: Reciprocal Relationships in Expression of Genes Associated with Osteoblast Prolife大鼠ion and Differentiation During Formation of the Bone Extracellular Matrix, J Cell Physiol143, 420, 1990
大鼠	大鼠, 初生	Osteoblastlike cells	Collagenase Type 2: 0.3%	MEM	Ernst, M., and Froesch, E.: Osteoblastlike Cells in a Serum-Free Methylcellulose Medium Form Colonies: Effects of Insulin and Insulinlike Growth Factor I, Calcif Tissue Int 40, 27, 1987
大鼠	大鼠, 胎兒, 17-21 天	Calvaria	Collagenase: 0.01%-0.6%	Tris-buffered saline	Peck, W., Birge, S., and Fedak, S.: Bone Cells: Biochemical and Biological Studies After Enzymatic Isolation, Science 146, 1476, 1964

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