??產(chǎn)品基礎(chǔ)信息

品牌：Promega

貨號：V5071、V5072、V5073

英文名：Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade

中文名：Trypsin/Lys-C 混合酶，質(zhì)譜級

規(guī)格：20ug、100ug

儲存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融

核心用途：蛋白質(zhì)組學(xué)分析、生物治療蛋白肽圖鑒定、質(zhì)譜樣品前處理

配套需求：建議搭配 100mM NH?HCO?（pH7.8）或 Tris-HCl（pH8.0）緩沖液使用

??產(chǎn)品詳細(xì)介紹

1. 成分與制備工藝

Trypsin/Lys-C 混合酶，質(zhì)譜級是 Promega 專為質(zhì)譜分析開發(fā)的雙酶復(fù)合試劑，由甲基化修飾Trypsin與重組 Lys-C 蛋白酶按優(yōu)化比例混合而成 。其中Trypsin源自豬胰腺基因的畢赤酵母重組表達(dá)體系，經(jīng) TPCK 處理去除凝乳蛋白酶活性，并通過甲基化修飾封閉賴氨酸殘基，從根源上減少酶分子自切 ；Lys-C則基于 A. Lyticus菌氨基酸序列，采用大腸桿菌重組技術(shù)制備，純度達(dá) 99% 以上且無雜酶污染 。

2. 酶切機(jī)制與反應(yīng)特性

雙酶協(xié)同實現(xiàn)互補(bǔ)切割：Lys-C特異性水解賴氨酸（Lys）和Arg羧基端肽鍵，而 Lys-C 僅識別賴氨酸位點 。這種組合不僅解決了單一酶對酸性殘基鄰近位點的切割盲區(qū)，還能在 6~8M 尿素等強(qiáng)變性環(huán)境中保持活性 —— 即使面對疏水性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)緊密的膜蛋白，也可通過變性劑輔助打開空間結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)高效酶切 。

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件為 37℃孵育 3~4 小時（高濃度尿素體系）或過夜（常規(guī)體系），酶與底物比例推薦 1:25（w/w），反應(yīng) pH 耐受范圍 7.5~8.5 。值得注意的是，該酶混合物在 2M 鹽酸胍中仍能保留 48% 活性，對樣本中常見的酶抑制劑（如血清 α1 - 抗Lys-C）具有天然耐受性 。

3. 適用場景與實例

蛋白質(zhì)組學(xué)研究：HeLa 細(xì)胞提取物酶切實驗顯示，V5071 可識別的肽段數(shù)量比單一酶提升 22%，蛋白鑒定總數(shù)增加 18% ；

生物治療蛋白分析：在單克隆抗體肽圖鑒定中，能精準(zhǔn)檢測脫酰胺等翻譯后修飾，肽段覆蓋率達(dá) 95% 以上 ；

低質(zhì)量樣本處理：針對福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，可在抑制劑存在下仍獲得合格質(zhì)譜數(shù)據(jù) 。

??核心優(yōu)勢詳細(xì)介紹

1. 雙酶協(xié)同，肽段覆蓋率顯著提升

單一酶常因底物序列特性出現(xiàn)切割漏點，而 Lys-C 的加入可補(bǔ)充賴氨酸位點的強(qiáng)制切割。例如對人血清白蛋白的酶切實驗中，V5071 產(chǎn)生的可鑒定肽段數(shù)達(dá) 112 個，較單獨酶（89 個）提升 26%，且無新增非特異性切割峰 。這種優(yōu)勢在膜蛋白、多結(jié)構(gòu)域蛋白分析中尤為突出。

2. 甲基化修飾，自切率降低 90%

普通酶在反應(yīng)中易發(fā)生自水解，產(chǎn)生干擾質(zhì)譜信號的雜肽。V5071 的酶經(jīng)甲基化修飾后，37℃孵育 3 小時的自切片段僅占總酶量的 3%，遠(yuǎn)低于未修飾酶的 32% 。這一特性使酶切產(chǎn)物無需額外純化即可直接上樣，大幅簡化實驗流程。

3. 抗抑制劑與強(qiáng)變性耐受，適配復(fù)雜樣本

臨床樣本（如血清、組織勻漿）中含有的蛋白酶抑制劑常導(dǎo)致常規(guī)酶失效，而 V5071 可耐受 1μg/mL 的 α1 - 抗Lys-C（常規(guī)酶耐受上限為 0.2μg/mL） 。同時，其在 6M 尿素中仍保持 85% 活性，特別適合難溶蛋白的酶切處理 。

4. 無動物源性污染，符合生物藥質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

重組 Lys-C 的使用避免了天然提取酶可能攜帶的病毒、支原體污染，酶雖源自動物基因但通過酵母表達(dá)，無宿主動物蛋白殘留 。每批次產(chǎn)品均通過 HPLC 純度檢測（≥98%）和質(zhì)譜干擾測試，符合 FDA 對生物治療產(chǎn)品分析的要求。

5. 批次穩(wěn)定性優(yōu)異，實驗重復(fù)性有保障

Promega 對 V5071 實施嚴(yán)格的批次間質(zhì)控：連續(xù) 10 個批次的酶切效率變異系數(shù)（CV）≤5%，37℃活性保留率均≥90% 。這種穩(wěn)定性對高通量實驗和長期項目研究至關(guān)重要，可有效減少因試劑差異導(dǎo)致的結(jié)果波動。

? 常見疑問與解答

Q1：V5071 與 V5072、V5073 的區(qū)別是什么？

A：三者核心成分相同，僅規(guī)格不同：V5071 為 20μg 單支裝，適合小樣本預(yù)實驗；V5072 為 100μg 單支裝，性價比更高；V5073 為 5×20μg 分裝，可避免反復(fù)凍融影響活性 。實驗效果無差異，可根據(jù)樣本量選擇。

Q2：酶切后如何終止反應(yīng)？是否影響質(zhì)譜檢測？

A：推薦兩種方式：① 加入終濃度 0.1% 的TFA調(diào)節(jié) pH 至 2.0；② 95℃加熱 10 分鐘。兩種方法均不會產(chǎn)生質(zhì)譜干擾峰，前者更適合后續(xù)反相色譜分離 。

Q3：凍干粉如何復(fù)溶？復(fù)溶后可保存多久？

A：用無核酸酶水或試劑盒配套緩沖液復(fù)溶至 1μg/μL，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。若需短期保存，可分裝后 - 20℃存放 1 周，避免反復(fù)凍融（會導(dǎo)致活性下降 30%/ 次） 。

Q4：能否用于膠內(nèi)蛋白消化？操作時有哪些注意事項？

A：適用！需注意：① 膠塊需用乙腈脫水至透明；② 還原烷基化后需清洗去除試劑；③ 酶與膠內(nèi)蛋白比例可提高至 1:10（w/w），孵育時間延長至 16 小時 。實測對 10ng 膠內(nèi)蛋白的鑒定率達(dá) 90% 以上。

Q5：與普通測序級酶相比，V5071 的價格更高，值得購買嗎？

A：從綜合成本看更劃算！普通酶需額外購買 Lys-C 并優(yōu)化比例（耗時 2~3 天），且自切產(chǎn)物多需純化（增加試劑成本）。V5071 的預(yù)混配方可直接使用，酶切效率提升減少了樣本損耗，尤其適合珍貴樣本分析 。

Q6：反應(yīng)體系中能否添加表面活性劑？

A：推薦搭配 Promega ProteaseMax™表面活性劑（貨號 V2071），終濃度 0.1% 即可提升難溶蛋白的酶切效率 30%，且該表面活性劑可在 95℃加熱 5 分鐘降解，無質(zhì)譜干擾 。避免使用 SDS（濃度＞0.1% 會抑制活性）。

Q7：低 pH 環(huán)境下能否使用？

A：優(yōu)良反應(yīng) pH 為 8.0，若需在酸性條件（pH5.0 以下）酶切，建議搭配 Promega AccuMAP™低 pH 消化試劑盒，其配套的耐酸 Lys-C 可與 V5071 協(xié)同工作 。

Q8：產(chǎn)品保質(zhì)期多久？過期后還能使用嗎？

A：未開封產(chǎn)品在 - 20℃保存可穩(wěn)定 2 年（以標(biāo)簽標(biāo)注為準(zhǔn)）。過期后酶活性會下降，實測過期 3 個月的產(chǎn)品酶切效率降低 40%，不建議用于定量分析 。

Q9：是否提供質(zhì)量檢測報告？

A：每批次產(chǎn)品均附帶 COA（分析報告），包含 HPLC 純度、SDS-PAGE 電泳圖、活性測定數(shù)據(jù)等，可通過 Promega 輸入貨號和批次號查詢 。

Q10：出現(xiàn)酶切效率低的情況，可能是什么原因？

A：常見因素包括：① 樣本未充分變性（可增加尿素濃度至 8M）；② 酶與底物比例過低（建議調(diào)整至 1:20）；③ 緩沖液 pH 偏離 8.0；④ 存在金屬離子抑制劑（可添加 1mM EDTA） 。

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