探針法支原體檢測試劑盒說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實驗試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè)，圓夢中國。

產(chǎn)品詳情

 產(chǎn)品描述

《探針法支原體檢測試劑盒》具有支原體識別率、最高的檢測靈敏度、最高的檢測正確率、含內(nèi)參對照 從而可以區(qū)分真陰性樣品和假陰性樣品等一系列優(yōu)點，該方法被認(rèn)為是支原體快速檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。如果您實驗室 已經(jīng)擁有（或者打算購買）熒光定量 PCR 儀，我們強烈推薦您選擇《探針法支原體檢測試劑盒》。

經(jīng)測試，本公司開發(fā)的《探針法支原體檢測試劑盒》至少可以識別在體外細胞培養(yǎng)中曾經(jīng)報道出現(xiàn)的 20 種支 原體，根據(jù)文獻報道，這些支原體基本上占污染細胞的支原體種類的 100%。具體如下：（1）M. hyorhinis、（2） M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、 （20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為 Mycoplasma 的縮寫；A.為 Acholeplasma 的縮寫）。

根據(jù)支原體 DNA 的 序列，本試劑盒可以識別 100 多種至今已發(fā)現(xiàn)的支原體，具有廣譜的識別能力。

產(chǎn)品組分

（1） 探針法溶液 1P：550 μL（50 次），含支原體和內(nèi)參檢測用引物及熒光探針;

（2） 探針法溶液 2T：50 μL（50 次），酶溶液;

（3） 內(nèi)參質(zhì)粒 mycoIC2：500 μL;

（4） 去離子水：1.2 mL；

（5） 陽性支原體 DNA：50 μL。

使用方法

使用方法

待測樣品的前處理 為了準(zhǔn)確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養(yǎng)液樣品需要取自換液后培養(yǎng) 2-3 天且匯合度在 90% 左右的細胞培養(yǎng)液上清（貼壁細胞）。懸浮培養(yǎng)的細胞也需要在換液傳代后，讓細胞生長 2-3 天再取培養(yǎng)液進行檢 測。可以按照以下兩種方法之一進行樣品的前處理： 方法一：對樣品進行支原體 DNA 的提取。 很多樣品（比如：培養(yǎng)很多天的細胞上清、血清、血漿等）由于含有抑制 PCR 擴增的成分，如果樣品不進行 前處理而直接檢測，有可能導(dǎo)致 qPCR 擴增失敗（qPCR 結(jié)果：支原體通道和內(nèi)參對照通道均無擴增曲線）。該類樣品建議客戶進行樣品 DNA 提取（或者離心清洗，見后文方法二）后，再進行檢測。提取 DNA 的過程有兩個作用：

（1）基本可以去除所有抑制 PCR 擴增的成分，保證后續(xù)定量 PCR 擴增的正常進行；

（2）具有濃縮支原體 DNA 的作用，可以提高相對檢測靈敏度 10-100 倍。 樣品 DNA 的提取推薦使用本公司的《支原體基因組 DNA 提取試劑盒》。不同樣品支原體基因組 DNA 的提取步驟，請參考本公司的《支原體基因組 DNA 提取試劑盒》的說明書。

方法二：樣品不經(jīng) DNA 提取（推薦方法。該方法不僅可以濃縮支原體從而提高相對檢測靈敏度，還可以去 除絕大部分可能的抑制物，PCR 擴增被抑制的可能性極低。如果該簡單一步離心清洗的方法仍然無法去除抑制 物，可以使用后文注意事項部分的三步離心清洗的方法。），具體方法如下：

（1）根據(jù)濃縮倍數(shù)，可以取 100 - 1500 μL 上述待測樣品到 1.5 mL 離心管內(nèi)，在普通臺式離心機上 1000 rpm (大約 150 g)低速離心 5 minutes，將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另一個離心管內(nèi)，丟棄細胞沉淀。

（2）將上清繼續(xù) 13000 rpm（約 16000 g）高速離心 5 minutes，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉 淀，可以保留底部 3-5 μL 液體），用 50μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去 離子水（樣品比較不穩(wěn)定，只適合當(dāng)天或短期內(nèi)檢測使用）重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻【如果最初使用了 1500 μL 的樣品，則支原體濃度大約提高了 30 倍】。

（3）往 50 μL 重懸后的樣品中加入 4 μL 內(nèi)參質(zhì)粒 mycoIC2【內(nèi)參質(zhì)粒融化后，請混勻后再吸取】。

（4）至此，該樣品可以直接進行檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩(wěn)定）。熱 處理具體如下：95 ℃加熱處理 5 minutes（可以轉(zhuǎn)移到 PCR 管內(nèi)，在 PCR 儀上進行加熱處理），簡單離心 （1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。 

實驗案例分析

陽性對照管：其 FAM 通道有典型的 S 型擴增曲線（即指數(shù)擴增），其 VIC 通道的擴增線呈直線或者S型曲線。

陰性對照管：其 FAM 通道的擴增線呈直線，其 VIC 通道應(yīng)該有典型的 S 型擴增曲線。

如果陽性對照管、陰性對照管同時滿足上述條件，則說明本次實驗結(jié)果有效，否則實驗結(jié)果無效。典型的陰性直線型擴增線和陽性 S 型擴增曲線如圖 1 所示：

圖 1. 典型的陰性直線型擴增線（左）和陽性 S 型擴增曲線（右）

注意事項

1. 實驗全過程，應(yīng)該佩戴一次性手套操作。

2. 如果出現(xiàn)qPCR的擴增被細胞的代謝產(chǎn)物抑制時（qPCR 結(jié)果：支原體通道和內(nèi)參對照通道均無擴增曲線）， 可以采取以下幾種措施：

1) 將取樣的時間提前到換液后 2 天或 3 天，此時細胞上清的 PCR 擴增抑制物相對比較少，一般不會產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制。據(jù)我們測試，換液后 5 天，PCR 擴增抑制物就已經(jīng)大量積累。

2) 用 PBS 對待測樣品進行離心清洗，去除樣品中的抑制物。具體方法如下：取 1 mL 細胞上清，先 13000 rpm 離心 5 minutes，吸走 950 μL 上清；加 PBS 950 μL，再次離心，吸走 950 μL 上清；再加 PBS 950 μL， 第三次離心，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部 3-5 μL 液體），用 50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理 5 minutes，簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。但是該方法有如下缺點：第一，如果樣品支原體含量較少，離心清洗可能導(dǎo)致漏檢，因為離心清洗過程中，可能導(dǎo)致支原體部分丟失。第二，個別樣品，即使經(jīng)過上述清洗也無法去除抑制劑。

3) 使用支原體基因組 DNA 抽提試劑盒（推薦使用本公司《支原體基因組 DNA 提取試劑盒》），抽提細胞上清的支原體 DNA 后再進行 PCR 鑒定。

4) 使用本公司生產(chǎn)的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》或者《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》進行檢測，經(jīng)測試，未發(fā)現(xiàn)這兩種試劑盒會被細胞的代謝產(chǎn)物所抑制。

為了預(yù)防 PCR 的擴增被細胞的代謝產(chǎn)物抑制的問題，也可以考慮將所有待測樣品全部進行離心清洗或者DNA 提取后，再使用本試劑盒進行檢測。

3. 支原體檢測樣品可以分成兩類：第一類，用含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)的哺乳動物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養(yǎng)數(shù)天后，支原體密度一般較高，可達10^7-9/mL，可以直接檢測。第二類，低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養(yǎng)液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：

（1）對樣品的支原體進行離心濃縮或者使用本公司《支原體基因組 DNA 提取試劑盒》將支原體 DNA 濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續(xù)提高 10-100 倍。該方法速度快，當(dāng)天出結(jié)果，但是可靠性不如后面的培養(yǎng)法。

（2）使用支原體液體培養(yǎng)基（必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的兩種支原體液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)3-7 天后，再進行檢測。具體方法請參考本公司《發(fā)光法支原體檢測試劑盒》說明書中最后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要 3-7 天，但是可靠性高。